1. Трехмерный анализ содержимого просветов внутри кист и органоидов [Техническое примечание]
2. Автоматизированная флуоресцентная количественная оценка жизнеспособности клеток

Цветная растровая электронная микрофотография человеческого яйца с остаточными коронарными клетками из фолликула яичника. Предоставлено: Йоргос Никас, Wellcome Images.

Знаменитая фраза «картинка стоит тысячи слов» говорит о том, насколько большое значение мы придаем визуальной информации в нашем стремлении понять и оценить наш мир. Ученые начали «видеть» биологию очень давно, начиная с наблюдения макроскопических структур вплоть до их строительных блоков, а именно клеток.
Подобно тому, как физики продолжают открывать элементарные частицы, которые составляют другие, клетки не являются окончательным строительным блоком тканей. Тем не менее, клетки составляют важную организационную единицу, которая обеспечивает важные биологические процессы, и наблюдение за ними многому нас научило. Эритроциты были обнаружены с помощью микроскопии в 16581 году, и вскоре после этого Роберт Гук ввел термин «клетка» для обозначения многочисленных «пор», из которых состоит пробка2.
С тех пор микроскопия стала важным вспомогательным инструментом для биологов, который постоянно совершенствуется для достижения все более высоких разрешений. Это, несомненно, привело к значительному прогрессу в понимании болезней; Микроскопия была настолько бесценна для исследований, что теперь она медленно включается в процесс открытия лекарств.
Этот переход не будет легким, так как изображение было сформировано потребностями и средствами академического мира. Так стоит ли снимать изображения с камеры?

Трехмерный анализ содержимого просветов внутри кист и органоидов [Техническое примечание]

В этом техническом примечании мы описываем, как визуализировать и анализировать эпителиальные кисты почки Мадина-Дарби (MDCK) в 3D в системе анализа с высоким содержанием Operetta CLS ™, преодолевая самые критические проблемы 3D-анализов.

Дополнительная информация
Измеримое искусство Изучение изображений клеток всегда очаровывало как ученых, так и непрофессионалов, поскольку оно раскрывает красоту биологии и придает смысл понятиям, принадлежащим микроскопическому миру, которые трудно осмыслить.
Конфокальное изображение пастельных нейронов в гиппокампе мозга мышей Brainbow, причем каждый нейрон выражает свой особый цвет.Предоставлено: Jean Livet, 2007 г. Конкурс цифровых изображений Olympus BioScapes, Лаборатория Джеффа Лихтмана, Гарвардский университет, Кембридж, Массачусетс, США.

С появлением флуоресцентной микроскопии клеточная визуализация действительно стала искусством: теперь мы можем маркировать конкретные клетки или части клеток различными красителями и визуализировать их в 3D благодаря достижениям в 3D-визуализации.
Тем не менее, эти изображения не только эстетически приятны: они невероятно богаты информацией. Как отмечает доктор Моэндарбари, лектор Лондонского университетского колледжа:
«Визуализация физических объектов - это всегда лучший способ понять их».

Существует множество интересных функций для извлечения из изображений, многие из которых можно определить количественно с помощью высокоспецифичных флуоресцентных маркеров. Начнем с того, он говорит, что визуализация клеток «может показать нам, как клетки выглядят в первую очередь, чтобы мы могли обнаружить связь между их формой и функцией».
Среди других показателей, которые могут быть визуально определены количественно, доктор Педриги, доцент в Университете штата Небраска, выделяет «морфологию клеток, пролиферацию, миграцию и повышающую / понижающую регуляцию генов и белков в ответ на условия эксперимента; где это уместно, внутриклеточные процессы также могут быть определены количественно как функция пространственного положения внутри клетки ».
Наконец, изображение может также показать больше, чем кажется на первый взгляд, как объяснил доктор Педриги:
«Существует множество методов изучения механического поведения клеток, большинство из которых требуют визуализации для визуализации деформации клетки под воздействием нагрузки; например, цитометрия с магнитными шариками, оптический пинцет и атомно-силовая микроскопия ». Как отмечает д-р Педриги, исследование механических сил является важным, поскольку« исследования показали, что измененное механическое поведение и свойства клеток могут быть связаны с дисфункциональными фенотипами ».

Автоматизированная флуоресцентная количественная оценка жизнеспособности клеток

Измерение жизнеспособности клеток является ключевым для изучения цитотоксичности соединений, инфекции, болезней и других аспектов здоровья клеток. Благодаря недавнему внедрению автоматизированных систем визуализации флуоресценции и оптимизированных комплектов для окрашивания жизнеспособности теперь вы можете легко создавать высококачественные флуоресцентные изображения и количественно определять их для получения данных о жизнеспособности с высокой статистической мощностью.

Дополнительная информация
Следите за клетками. Итак, какова реальная добавленная стоимость изображений клеток?В конце концов, есть много других очень информативных тестов, таких как ELISA, PCR и Western Blots.
Очевидно, что, в отличие от биохимических тестов, визуализация уникальным образом обеспечивает ключевую фенотипическую информацию (хотя последние достижения показали, что флуоресцентно-активируемая сортировка клеток, FAC в сочетании с визуализацией клеток3).
Что-то, что, возможно, менее очевидно, заключается в том, что при считывании из стандартных биохимических анализов, как правило, отсутствует один ключевой аспект, который обеспечивает визуализация: топографическая информация.
В некоторых биохимических анализах анализируется содержание, объединенное из всего анализа, что означает, что мы не можем знать, какая субпопуляция клеток ответственна за обнаруженный сигнал.Вместо этого мы усредняем результаты по целой популяции клеток, которые могут быть весьма неоднородными, и таким образом упускаются важные различия между клетками4.Интересно, что лазерная микродиссекция позволяет нам выбирать конкретные клетки в рамках анализа для последующего анализа, но в фиксированных тканях5.С другой стороны, в то время как другие анализы, такие как FAC, позволяют проводить анализ отдельных клеток, они все же не позволяют ученым связывать результаты с первоначальным расположением клеток в анализе.Это связано с тем, что клетки должны быть отделены от первоначального анализа для прохождения через инструмент в виде отдельных клеток.
Напротив, визуализация клеток позволяет изучать отдельные клетки, но также позволяет соотносить результаты с их расположением в анализе.Другими словами, мы можем шпионить за клетками, визуализировать их физическое взаимодействие с другими клетками и исследовать влияние микросреды на их поведение.Это очень важно, поскольку в настоящее время появляется все больше доказательств того, что клетки активно взаимодействуют с их микросредой при гомеостазе и таких заболеваниях, как рак6,7.Еще важнее то, что теперь мы знаем, что микросреда может влиять на реакцию клеток на лекарства8.

Хемотаксическая миграция Т-клеток путем визуализации живых клеток.Предоставлено: Explicyte Immuno-Oncology.
Другое важное преимущество визуализации (живых) клеток состоит в том, что она позволяет изучать динамические клеточные процессы, в отличие от других стандартных тестов, которые по своей сути ограничены выполнением в заданный и конечный момент измерения времени.Это может однозначно информировать ученых о важнейших процессах, таких как миграция, которая является отличительной чертой таких болезней, как рак, и может быть фармакологически направленной.

Можем ли мы когда-нибудь отпустить? Сканирование клеток невероятно мощно, но имеет некоторые ограничения. По словам доктора Моэндарбари, «очень просто визуализировать клетки в фиксированные моменты времени, однако визуализация живых клеток может быть более сложной».
Среди других осложнений механический и тепловой дрейф может легко возникнуть при визуализации в реальном времени, что может разрушить весь эксперимент. Параллельно доктор Моэндарбари также отмечает, что «для получения изображений с высоким разрешением внутренней клеточной структуры требуются более совершенные микроскопы, которые менее доступны и дороги».
Более неотъемлемое ограничение визуализации клеток in vitro связано с его физиологическим значением. Тем не менее, это постепенно улучшается с все более сложными анализами, такими как органы на чипах. С другой стороны, визуализация in vivo возможна и невероятно мощна9, но, как правило, требует еще более сложного оборудования, персонала и финансирования.
В более общем смысле, для визуализации клеток требуется квалифицированный персонал, и он может занимать довольно много времени, так как скорость его получения и пропускная способность довольно низкие по сравнению с другими биохимическими анализами3. Это также может быть смехотворно, особенно когда лаборатории переходят к визуализации сложных трехмерных клеточных анализов.
Кроме того, окрашивание и визуализация живых клеток могут иметь токсические побочные эффекты. Существует отдельная проблема, связанная с анализом изображений, которая может быть технически сложной. Предпринимаются усилия по преодолению этих ограничений, поскольку компании разрабатывают автоматизированные платформы обработки изображений вместе с программным обеспечением для анализа для получения изображений с более высокой пропускной способностью.
По словам доктора Педриги, «существует множество аспектов визуализации клеток, которые включают рутинные и основные задачи, которые можно автоматизировать, чтобы сэкономить время для биологического исследователя».
Несмотря на все усилия по автоматизации визуализации, нельзя забывать, что ученые любят смотреть на свои клетки, чтобы иметь прямое представление о том, что происходит; им было бы трудно полностью отказаться от этой задачи.
Но, как отмечает д-р Педриги, «если можно показать, что автоматизированные задачи выполняются так же точно, как и вручную, весьма вероятно, что они будут приняты многими в исследовательском сообществе».
Другими словами, ученые должны быть убеждены в том, что инструменты могут правильно выполнять визуализацию, поскольку они знают, насколько это может быть сложно, и насколько уникальны их протоколы.
Сканирующая электронная микрофотография эритроцитов, четко показывающая форму их двояковогнутого диска. Предоставлено: Энни Кавана, Wellcome Images.
Заключение. Сканирование клеток стало само по себе увлекательной областью, порождающей большой энтузиазм и понимание (в буквальном смысле) множества новых биологических процессов.
Тем не менее, большая часть этой визуализации все еще относится к академическим исследованиям, которые можно получить, полагаясь на трудоемкие и хитроумные протоколы визуализации.
Необходимо приложить больше усилий для адаптации протоколов к высокой пропускной способности и надежным рабочим процессам для более эффективной разработки лекарств.
Необходимо позаботиться о том, чтобы не создавать инструменты, которые полностью автоматизируют процесс или обходят пользователя: ученым нравится видеть клетки для себя. Все это может и должно быть сделано, поскольку визуализация неизбежно добавляет огромную ценность к разработке лекарств, особенно в отношении недавно обнаруженного влияния клеточной микросреды на терапию.
Другими словами, теперь нам нужно разрабатывать лекарства также в зависимости от непосредственного окружения клеток, которые могут быть уникально изучены и протестированы путем визуализации клеток в сложных анализах in vitro.
Итак, сколько слов на самом деле стоит изображение клетки?
Клеточные изображения теперь доказали, что они стоят тысячи, если не много. С высокой пропускной способностью изображения это число будет расти в геометрической прогрессии. Но количество - это не качество: скорее, нам нужно лучше извлекать релевантные данные с более высокой пропускной способностью из изображений, и, что более важно, нам нужно улучшить рабочие процессы, которые могут упростить визуализацию, и объединить их с другими биохимическими анализами.
Список литературы: 1.Хайду, С.И. Заметка из истории: Открытие клеток крови. Энн. Clin. Лаборатория Научный 33, 237–8 (2003).

2. Райан Дж., Герхольд А.Р., Будро В., Смит Л. и Мэддокс П.С. Введение в современные методы световой микроскопии. Методы Мол. Биол . 1563 , 1–15 (2017).

3.Басиджи Д.А., Ортын В.Е., Лян Л., Венкатачалам В. и Моррисси П. Анализ клеточных изображений и визуализация методом проточной цитометрии. Clin. Лаборатория Мед . 27 , 653–670 (2007).

4.Джункин М., Тай, С. Микрофлюидный одноклеточный анализ для системной иммунологии. Лабораторный чип 14 , 1246–60 (2014).

5. Фрост А.Р., Элтум И.Э., Сигал Г.П., Эммерт-Бак М.Р. и Тангреа М.А. Лазерная микродиссекция. Тек. Protoc. Mol. Биол . 112 , 25A.1.1-30 (2015).

6. Джойс, Дж. А. Поллард, Дж. В. Микроэкологическая регуляция метастазирования. Туземный Rev. Cancer 9 , 239–52 (2009).

7. Пикап М.В., Моуу Дж.К. и Уивер В.М. Внеклеточный матрикс модулирует признаки рака. EMBO Rep. 15 , 1243–53 (2014).

8. Сын Б. и соавт. Роль микроокружения опухоли в терапевтической резистентности. Цель 8 , (2017).

9. Сахай, Э. Подсветка метастатического процесса. Туземный Rev. Cancer 7 , 737–49 (2007).