- Структура и состав GQD Для исследования собственной кристаллической структуры GQD была проведена...
- In vitro визуализация и ФДТ
- In vivo изображений и PDT
Структура и состав GQD
Для исследования собственной кристаллической структуры GQD была проведена сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (STEM). Рисунок 1а представляет STEM-изображение GQD с диаметрами в диапазоне от 2 до 6 нм. TEM (HRTEM) наблюдения GQD высокого разрешения в Рис. 1б раскрывает кристалличность GQD; помеченное межплоскостное расстояние 0,21 нм согласуется с (100) расстоянием решетки графена вдоль направления [001], а расстояние 0,31 нм соответствует краям решетки плоскостей (002) 29 , 30 , Типичная рентгенограмма и спектр комбинационного рассеяния ( Дополнительный рис. 1 ) далее проверьте конфигурацию sp2 GQD 31 , 32 , Измерения рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) были выполнены для исследования состава GQD. Обзорный спектр в Рис. 1б указывает на наличие углерода, азота, серы и кислорода; деконволюция XS-спектров высокого разрешения C1s ( Рис. 1с ) показывает пики при 285,0, 285,7, 286,2 и 289,7 эВ, что соответствует связям C – C, C – N, C – S и C – O соответственно. Содержание азота и серы было оценено как 1,6% и 5,8% соответственно ( Дополнительный рис. 2а ). Спектры высокого разрешения N1s и S2p в Дополнительный рис. 2б, в также поддерживают образование связей C – N и C – S, что подразумевает включение азота и серы в GQD. Кроме того, кислород физически и химически адсорбируется на GQD ( Дополнительный рис. 2г, д ).
Рисунок 1: Характеристика GQD.
( а ) изображения ПЭМ. Масштабная линейка, 20 нм. ( б ) HRTEM изображения. Масштабная линейка, 2 нм. ( c ) Спектр съемки XPS. ( d ) Деконволюция Xs-спектров высокого разрешения C1s.
Фотофизические и фотохимические свойства GQD
Рисунок 2а представлены спектры УФ-видимого поглощения и ФЛ GQD, иллюстрирующие, что GQD имеют широкое поглощение от 400 до 700 нм и пик ярко-красного излучения при 680 нм. GQD показали большой стоксов сдвиг 205 нм, что означает, что самопоглощение их излучения и помехи измерения между возбуждающим светом и рассеянным светом могут быть минимизированы. Чтобы дополнительно понять люминесцентные свойства, измеренные во времени спектры ФЛ водного раствора GQD были измерены при возбуждении 488 нм. Анализ кинетики затухания флуоресценции выявил три экспоненциальных затухания с наибольшим временем жизни 7,52 нс ( Рис. 2б ); время жизни на уровне ns указывает на характер синглетного состояния излучения GQD. Измеренный квантовый выход флуоресценции GQD составлял 0,054 в атмосфере O2 с использованием спектрометра, прикрепленного к интегрирующей сфере. Как время жизни флуоресценции, так и квантовый выход флуоресценции GQD увеличивались, когда измерения проводились в атмосфере воздуха или азота. Аналогичная тенденция наблюдалась и в 9,10-дицианоантрацене, который содержит ароматическое конденсированное кольцо с большой π-сопряженной структурой и обеспечивает генерацию 1O2 из синглетного и триплетного состояний ( Дополнительная таблица 1 ) 33 , Кроме того, GQD продемонстрировали превосходную фотостабильность по сравнению с КТ CdTe (обычные полупроводниковые КТ с красным излучением) и протопорфирином IX (PpIX, классический фотосенсибилизатор); Рис. 2с а также Дополнительный Рис. 3 ) а также хорошая стабильность pH ( Дополнительный Рис. 4 ), которые необходимы для биомедицинских применений 34 , 35 , 36 ,
Рисунок 2: Фотофизические и фотохимические свойства GQD.
( а ) Нормализованные УФ-видимые спектры поглощения и эмиссии ( λ ex = 500 нм) GQD, диспергированных в воде при комнатной температуре. На вставках показаны фотография и флуоресцентное изображение раствора GQD в ультрафиолетовом свете (365 нм). ( б ) Кривая затухания флуоресценции (черная линия) GQD, зарегистрированных при 680 нм с возбуждением 488 нм. Красная линия: шум прибора; синяя линия: подгонка кривой затухания флуоресценции. Fit = A + B1exp (- t / τ 1) + B2exp (- t / τ 2) + B3exp (- t / τ 3; τ 1 = 0,27 нс, τ 2 = 1,10 нс, τ 3 = 7,52 нс). ( c ) Сравнение фотостабильности GQD, CdTe QD и PpIX. Все образцы непрерывно облучали ксеноновой лампой мощностью 500 Вт. A0 и A - оптическая плотность образцов при 470 нм до и после облучения соответственно. После 75 мин облучения не наблюдалось явного снижения поглощения GQD, в то время как поглощение PpIX и Qd CdTe уменьшилось ниже 78% от их первоначального значения. ( d ) Сигналы ЭПР 1O2 (вверх) и других АФК (вниз), полученные при облучении GQD в течение 8 минут в присутствии 2,2,6,6-тетраметилпиперидина и 5-трет-бутоксикарбонил-5-метил-1- N- оксид пирролина соответственно. ( e ) Нормализованная абсорбция Na2-ADPA при 378 нм как функция времени облучения в присутствии GQD и RB. ( f ) Излучение 1O2 при ~ 1280 нм, вызванное GQD и RB в растворе смеси CH3CN-D2O (об. / об. = 15/1) при возбуждении лазером с длиной волны 532 нм.
Метод электронного спинового резонанса (ЭПР) использовался для обнаружения генерации АФК с помощью GQD при облучении. 2,2,6,6-тетраметилпиперидин и 5-трет-бутоксикарбонил-5-метил-1-пирролин- N- оксид использовали в качестве ловушек 1O2 и O2- (или ОН) соответственно. Как показано на Рис. 2d (сверху, красная линия) и Дополнительный Рис. 5 характерный сигнал, индуцированный 1О2, 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил, наблюдался в спектрах ЭПР только при облучении, и его интенсивность увеличивалась с увеличением времени облучения. Других сигналов АФК не наблюдалось ( Рис. 2d , низ). Эти результаты подтверждают, что именно передача энергии (ET), а не перенос электрона, от GQD к кислороду отвечает за сенсибилизацию кислорода в основном состоянии2. Чтобы оценить способность GQD генерировать 1O2, квантовый выход 1O2 измеряли с использованием метода химического улавливания с динатрий-9,10-антрацендипропионовой кислотой (Na2-ADPA) в качестве улавливающего агента и с розовой бенгалией (RB) в качестве стандартного фотосенсибилизатора (1O2 квантовый выход Φ RB = 0,75 в воде) 14 , Как показано на Рис. 2e в присутствии GQD или RB при облучении белым светом поглощение раствора Na2-ADPA при 378 нм постепенно уменьшалось с продолжительным временем облучения, что указывает на деградацию Na2-ADPA на 1O2, генерируемую GQD и RB 37 , Тем не менее, скорость разложения Na2-ADPA в результате GQD была намного выше, чем в RB. Таким образом, квантовый выход 1O2 раствора GQD был рассчитан как 1,3 ( Дополнительный Рис. 6 а также Дополнительное примечание 1 ). Кроме того, измерения при различных длинах волн возбуждения, 538, 549 и 562 нм, также выявили почти постоянный квантовый выход 1O2 GQD ~ 1,3 ( Дополнительный Рис. 7 а также Дополнительная таблица 2 ).
Путем сравнения площадей пиков излучения 1O2 при ~ 1280 нм, индуцированных GQD и RB в растворе CH3CN-D2O при возбуждении лазером с длиной волны 532 нм, квантовый выход GQD 1O2 был определен равным 1,34 на основе известного значения Φ RB = 0,76 в CH3CN, как показано на Рис. 2f (рефов 38 , 39 ). Этот результат очень хорошо согласуется с результатом, полученным с использованием метода химической ловушки, описанного выше. Дальнейшие исследования показали, что квантовые выходы 1O2 поддерживались на уровне ~ 1,3 при значениях pH в диапазоне от 6 до 8 ( Дополнительная таблица 3 ). Насколько нам известно, эта эффективность является самой высокой эффективностью генерации 1O2, когда-либо зарегистрированной для агентов ФДТ, и примерно в два раза выше, чем у всех современных агентов ФДТ 6 , 12 ,
In vitro визуализация и ФДТ
Эти высоко фотостабильные, диспергируемые в воде и красные эмиссионные GQD могут быть использованы в качестве агентов для флуоресцентной визуализации. Окрашивание клеток HeLa GQD приводило к сильному выбросу PL из клеток; соответствующее флуоресцентное изображение в Рис. 3а демонстрирует, что GQD помечены только цитоплазмой, а не ядром, аналогично наблюдениям для других C-точек 40 ,
Рисунок 3: изображение in vitro и ФДТ.
( а ) Изображение конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, меченных GQD (0,4 мкМ). Масштабная линейка, 20 мкм. ( b ) зависящее от времени конфокальное светлое поле и ( c ) соответствующие флуоресцентные изображения клеток HeLa, инкубированных с GQD (0,4 мкМ) и Hoechst 33342 (1,8 мкМ) после облучения лазерами с длиной волны 405 и 633 нм. Масштабная линейка, 50 мкм. Зависимые от дозы эффекты ФДТ на жизнеспособность клеток HeLa: ( d ) GQD в диапазоне концентраций 0,036–1,8 мкМ и ( e ) PpIX в диапазоне концентраций 0,36–18 мкМ.
Фотодинамическую активность GQD против раковых клеток исследовали путем мониторинга изменения морфологии клеток HeLa в присутствии GQD с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. В этих экспериментах Hoechst 33342 также добавляли для окрашивания ядра. Как показано в Рис. 3б Облучение привело к изменениям морфологии клеток, в том числе к усадке клеток и образованию многочисленных пузырьков. Соответствующие флуоресцентные изображения в Рис. 3с а также Дополнительный Рис. 8 также подтверждают, что фотоиндуцированная гибель клеток сопровождалась ядерной конденсацией 41 , 42 , Процесс гибели клеток также представлен в двух видеофайлах, которые были записаны с помощью яркого поля и флуоресцентных микроскопов ( Дополнительные фильмы 1 и 2 ). В контрольных экспериментах клетки не претерпевали явных морфологических изменений в отсутствие GQD ( Дополнительный Рис. 9 ).
Стандартный количественный анализ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолийгидробромида (МТТ) проводили для количественной оценки эффективности ФДТ и цитотоксичности GQD по сравнению с классическим фотосенсибилизатором PpIX. В этих экспериментах клетки HeLa облучали в течение 10 минут в фосфатно-буферном растворе (PBS) с GQD от 0,036 до 1,8 мкМ или PpIX от 0,36 до 18 мкМ, как показано на Рис. 3d, е соответственно. Жизнеспособность клеток 60% наблюдалась в присутствии 0,036 мкМ GQD; эта величина уменьшалась с увеличением концентрации GQD, уменьшаясь до ~ 20% для раствора GQD с концентрацией 1,8 мкМ. Тем не менее, GQD оказывают небольшое влияние на выживание клеток HeLa в темноте даже при концентрации 1,8 мкМ, что указывает на низкую цитотоксичность и хорошую биосовместимость GQD. 23 , В отличие от этого, для 1,8-мкМ раствора PpIX в темноте было получено гораздо меньше жизнеспособности клеток, 55%, и более 35% клеток выжили даже после облучения ( Рис. 3е ). Дальнейшее увеличение концентрации PpIX не вызывало очевидного изменения жизнеспособности клеток. Также было отмечено, что GQD проявляют даже более сильный эффект PDT, чем PpIX, при одной десятой концентрации. Приведенные выше результаты подтверждают, что GQD превосходят PpIX с точки зрения как высокой эффективности PDT, так и низкой цитотоксичности.
In vivo изображений и PDT
Чтобы исследовать способность GQD к визуализации флуоресценции in vivo , 20 мкл водного раствора GQD (27 мкМ) инъецировали в спину голой мыши. Как изображено в Рис. 4а, б участки инъекции показали гораздо более высокую интенсивность флуоресценции, чем фоновый сигнал, производимый кожей мыши, и было достигнуто высокое отношение сигнал / шум, равное 229,5 ( Дополнительная таблица 4 ). Что еще более важно, никакого очевидного снижения интенсивности флуоресценции не наблюдалось в местах инъекции, и инъецированные GQD не демонстрировали очевидной диффузии даже через 1 неделю после инъекции ( Дополнительный Рис. 10 ).
Рисунок 4: визуализация in vivo и ФДТ.
( а ) изображение в ярком поле и ( б ) изображение с красной флуоресценцией после подкожной инъекции GQD в различных областях. Длина волны возбуждения составляла 502–540 нм, а собранный канал флуоресценции - 695–775 нм. ( c ) Фотографии мышей после различных обработок в 1, 9, 17 и 25 день. (PDT: GQDs + облучение светом; C1: только GQDs; C2: только облучение светом.) ( D ) Кривые роста опухоли, зависящие от времени ( n = 5) после различных обработок. Р <0,05 для каждой группы.
Эффективность GQD для PDT in vivo оценивали с использованием самок мышей BALB / nu с подкожными ксенотрансплантатами рака молочной железы в качестве модели на животных. Использовали три группы мышей, несущих зеленый флуоресцентный белок MDA MB-231, по 5 мышей на группу. Для группы PDT мышам внутривенно вводили GQD (доза = 4 мг / кг), а затем дважды, в первый и седьмой день, облучали в течение 10 минут белым светом (400–800 нм) при плотности мощности 80 мВт / см2. Контрольные группы включали мышей, которым вводили инъекцию GQD в той же дозе, но не облучали (группа C1), и мышей, которые не получали инъекцию GQD, но облучали (группа C2). Размеры опухоли измеряли с помощью штангенциркуля через день. Как показано на Рис. 4с в группе ФДТ опухоли сначала стали темными и гнойными, что немного увеличило размер опухоли. Опухоли начали разлагаться через 9 дней и были разрушены через 17 дней, оставляя черные шрамы на первоначальных участках, которые спадали спустя ~ 1 неделю 43 , В течение 50 дней в группе ФДТ не наблюдалось повторного роста опухоли. Напротив, опухоли в группах С1 и С2 значительно выросли в течение периода исследования ( Рис. 4d ) и проявляет сильную зеленую флуоресценцию ( Дополнительный Рис. 11 ), что указывает на то, что ни облучение светом, ни инъекция GQD не ингибировали рост опухоли. Наши эксперименты также исключали фототермический эффект GQD при уничтожении опухолевых клеток ( Дополнительный Рис. 12 а также Дополнительное примечание 2 ). Кроме того, токсичность GQD in vivo также приблизительно оценивали путем мониторинга изменения веса мышей в течение периода исследования, и никаких явных побочных эффектов обнаружено не было ( Дополнительный Рис. 13 ).
